Экспрессия и очистка рекомбинантной ДНК эндонуклеазы CRISPR/Cas системы

Abstract

В настоящее время ведется активная исследовательская работа по изучению и применению сайт-специфических РНК-направляющих эндонуклеаз в качестве инструментов для использования в области геномного редактирования и диагностики в биомедицинской и биотехнологической сфере. На сегодняшний день наиболее эффективным методом в этой области является метод CRISPR. Благодаря своей простоте нацеливания эта система была быстро принята в качестве метода выбора для редактирования геномов множества организмов. Совсем недавно в бактериальных геномах была обнаружена еще одна новая эндонуклеаза CRISPR-Cas класса 2 с характерными особенностями: Cas12a. Фермент Cas12a — это сайт-специфическая РНК-направляющая эндонуклеаза, которая может быть использо- вана для точного редактирования генома в различных типах клеток разных видов, а также применяться в диагностике. Поиск, идентификация и характеристика новых неизученных гомологов расширит потенциал использования ферментов. В данной работе проведена экспрессия и двухэтапная хромато- графическая очистка рекомбинантного фермента Cas12a высокой чистоты. Были получены invitro синтезированные crРНК, рибонуклеопротеиновый комплекс, и была подтверждена эндонуклеазная активность фермента в отношении субстрата, содержащего целевую последовательность для расщепления в соответствующем сайте. Полученный фермент может быть использован для дальнейшего описания его кинетических параметров, которые могут быть применены в разработке новых диагностик следующего поколения.